UJI DIAGNOSTIK MOLEKULER
Dalam bidang kedokteran (manusia maupun hewan), uji-uji diagnostik merupakan salah satu metode untuk menangani kasus penyakit. Berbagai uji diagnostik telah dikembangkan, baik yang didasarkan pada teknik kultur agen penyakit, reraksi kimia/biokimia maupun reaksi imunologik. Dengan berkembangnya teknologi dalam bidang biologi molekuler, maka pengembangan uji-uji diagnostik mulai diarahkan kepada teknologi tersebut yang menggunakan materi genetik sebagai dasar pengujiannya.
Materi genetik yang berupa asam nukleat baik DNA (Deoxy-ribose Nucleic Acid) maupun RNA (Ribo Nucleic Acid) mengandung tiga komponen, yaitu: 1) basa (purin dan pirimidin); 2) gula (deoksiribosa untuk DNA dan ribosa untuk RNA); dan 3) fosfat. Basa purin yang terdapat pada DNA maupun RNA adalah sama, yaitu Adenine [A] dan Guanine [G] sedangkan basa pirimidin berbeda, untuk DNA adalah Cytocine [C] dan Thymine [T] dan untuk RNA kedudukan Thymine digantikan oleh Uracil [U] Kedua unsur basa tersebut (purin dan pirimidin) akan berpasangan membentuk kode-kode genetik pada DNA maupun RNA melalui ikatan hidrogen (A akan berpasangan dengan T [pada DNA] atau A dengan U [pada RNA]; dan G dengan C). Unsur gula dan fosfat akan membentuk struktur DNA dan RNA. DNA memiliki struktur rantai ganda sedangkan RNA memiliki rantai tunggal. Struktur DNA lebih stabil bila dibandingkan dengan RNA. Berdasarkan materi genetik tersebut, uji-uji diagnostik dikembangkan melalui teknik-teknik molekuler seperti hibridisasi dengan probe asam nukleat; polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan sekuensing asam nukleat.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Salah satu perkembangan teknik biologi molekuler yang sangat membantu dalam pengembangan uji-uji diagnostik adalah PCR. PCR dapat mengamplifikasi DNA dan jumlah yang sedikit menjadi jumlah yang dapat dideteksi/banyak. Adanya penemuan DNA polymerase (Taq polymerase) yang stabil pada temperatur tinggi dan pengembangan alat yang mengatur temperatur proses PCR secara otornatis, telah membuat PCR dapat digunakan untuk uji-uji diagnostik secara praktis. DNA polymerase adalah enzim yang dapat mensintesis rantai DNA yang baru dan DNA yang sudah ada. Penemuan enzim yang tahan panas sangat membantu untuk mensintesis DNA baru, karena tahap awal proses PCR dilakukan dengan cara pemanasan rantai DNA yang sudah ada pada temperatur 90°C.
Reaksi Rantai Polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik sintesis untuk mengamplifikasi atau melipatgandakan fragmen DNA target secara invitro dengan eksponensial yang menggunakan primer atau pemula DNA yang tepat. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA in vivo. Berbeda dengan proses replikasi yang berlangsung secara diskrit untuk sepanjang rantai DNA, maka pada proses PCR reaksi ini berjalan kontinu, tetapi hanya untuk satu segmen tertentu saja dari suatu DNA.
Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary, B. Mullis pada tahun 1985. Impian Mullis dimulai ketika di bulan April, malam Jumat, 1983, saat membawa kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke Negara bagian utara California dimana Mullis mendapatkan inpirasi yang bermakna dengan menemukan cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang spesifik dari DNA. Penemuan yang mempesonakan itu dipublikasi pada American Scientific, 1990, yang memberiny peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah Nobel dalam kimia atas penemuan PCR. Semula Mullis menggunakan enzim Klenow fragmen E.coli DNA Polymerase I untuk memicu perpanjangan potongan DNA yang spesifik. Namun, enzim ini tidak dapat bertahan pada saat tahapan denaturasi dari PCR, sehingga mengharuskan penambahan enzim yang baru lagi pada setiap siklus PCR. Kondisi ini merupakan suatu hambatan yang kritis, khususnya pada teknik yang diharapkan berlangsung secara automatis. Klenow enzim dapat bekerja baik pada potongan DNA yang pendek (<200bp), tetapi tetapi tidak bis bekerja pada potongan DNA yang lebih besar, karena hasilnya yang memberikan sensitifitas yang rendah dan memperlihatkan hasil yang heterogen. Hal ini disebabkan karena tahapan annealing yang rendah dan perubahan temperatur (37’C) yang harus disesuaikan untuk mengaktifkan enzim Klenow. Situasi yang sangat memperihatinkan pada awal dimulainya PCR ini ialah bahwa teknik ini dilakukan secara manual dari satu waterbath ke waterbath lainnya sesuai tahapan dari PCR. Setelah beberapa tahun berikutnya didapatkan enzim thermostable DNA Polymerase yaitu Taq DNA Polymerase, PCR menjadi sangat populer dalam penelitian. Penemuan enzim ini juga memberi peluang untuk dilakukannya setiap tahapan PCR secara automatis, sehingga PCR sekarang telah dapat dikerjakan dengan mesin. Untuk mendeteksi potongan DNA yang spesifik dengan PCR diperlukan informasi dari tiap mikroorganisme yang memiliki potongan DNA yang spesifik untuk golongannya. Dengan merancang komplementer potongan DNA yang spesifik dari mikroorganisme tersebut, maka dapat dihasilkan pemula DNA atau disebut juga primer. Potongan DNA yang spesifik ini akan berikatan dengan pasangan yang komplementer dengannya, dan inilah yang dilipatgandakan atau diamplifikasi sampai jutaan dalam waktu sekitar 4 jam pada mesin PCR. Untuk mendukung amplifikasi tersebut diperlukan berbagai zat lainnya, kemudian divisualisasikan melalui elektroforesis dan proses hibridisasi. Keseluruhan proses PCR membutuhkan waktu hanya 2 hari. Pada perkembangan penggunaan PCR dilakukan pemurnian terhadap sampel yang akan di tes. Permunian sampel DNA dilakukan dengan memakai metode Boom (1990). Metode ini menggunakan Chaotropic agent guanidium thiocyanate (GuSCN) dan diatom. GuSCN dan diatom menghilangkan hambatan secara efisien terhadap berbagai macam sampel dari rumah sakit. GuSCN berfungsi untuk lisis dan menginaktifkan asam nukleat, sedangkan partikel silica ataupun diatom berfungsi mengikat asam nukleat. Untuk mengamplifikasi DNA dilakukan 30-40 kali siklus proses PCR. Satu siklus terdiri dari 3 tahap, yaitu tahap denaturasi pada temperatur 95°C, tahap hibridisasi primer pada temperatur 37° sampai 56°C dan tahap polimerisasi pada temperatur 72°C. Secara umum, DNA yang akan diamplifikasi diapit oleh sepasang primer sintetik yang merupakan potongan pendek dari DNA yang spesifik/komplementer yang berfungsi sebagai template dari DNA yang akan diamplifikasi. DNA target yang akan diamplifikasi didenaturasi terlebih dahulu dengan pemanasan, kemudian primer ditambahkan pada DNA target dan temperatur diturunkan agan terjadi proses hibridisasi. Bila tahap polimerisasi dimulai, maka rantai DNA target yang terdapat di antara primer akan diperbanyak menjadi dua rantai dengan panjang yang sama seperti DNA target. Dengan adanya pengulangan tahap-tahap denaturasi, hibridisasi dan polimerisasi beberapa kali, maka DNA target akan diperbanyak secana efektif. Bila enzim reverse transcriptase yang mensintesis DNA dan template RNA, digunakan pada tahap awal proses PCR, maka RNA ribosom dan genomik dan virus RNAjuga dapat diamplifikasi. Prinsip dasar suatu PCR adalah : pasangan primer menghibridisasi sekuens komplemen terget pada rantai DNA yang sebelumnya telah terdenaturasi. Sintesis DNA kemudian berlangsung dengan bantuan enzim polimerase di sepanjang daerah diantara primer. PCR dilaksanakan dengan cara menginkubasi sample pada temperatur yang berbeda pada tahap, dalam suatu siklus PCR, yaitu tahap : 1. Denaturasi Dengan pemanasan 95 oC rantai DNA akan berpisah, karena panas dapat merusak ikatan hidroksi antara basa-basa yang komplementar. 2. Annealing ( penempatan / pemasangan primer ) Primer dipasangakan pada tempat yang sesuai ( berkomplementer dengan rantai tunggal DNA ) melalui proses pembentukan iktan hidroksi.Untuk proses pemasangan primer ini dibutuhkan temperature yang berbeda dari setiap primer. 3. Extension ( Perpanjangan) Setelah primer ditempatkan pada posisi yang tepat, dimulailah proses pemanjangan rantai baru DNA yang berkomplementar, dengan bantuan enzim DNA polymerase sehingga terbentuk suatu fragmen rantai ganda DNA yang spesifik. Enzim yang stabil pada temperatur tinggi ini akan membantu proses penempaan nukleotida yang dibutuhkan sampai terbentuknya suatu rantai ganda DNA, temperatur optimal yang dibutuhkan untuk proses ini adalah 72o C. PCR dapat digunakan dalam uji-uji diagnostik untuk mengamplifikasi asam nukleat dan agen-agen penyakit yang ada dalam jumlah sedikit sehingga sensitifitas uji dapat ditingkatkan. DNA yang telah diamplifikasi selanjutnya diidentifikasi dengan teknik hibridisasi yang rnenggunakan probe asam nukleat yang spesifik, atau dengan analisis restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan elektroforesis pada gel agarose atau dengan cara sekuensing. Perkembangan selanjutnya terhadap pemanfaatan mesin PCR, dibedakan antara PCR unipleks dan PCR multipleks. Bila digunakan hanya satu pasang primer disebut PCR unipleks, sedangkan PCR yang menggunakan lebih dari satu pasang disebut PCR multipleks tak ada perbedaan pada tahapan denaturasi, annealing dan elongation, terkecuali pada kandungan PCR-miks, waktu tahapan dan jumlah sikling temperatur. PCR Unipleks dapat dipakai untuk diagnosis terhadap penyebab penyakit infeksi, termasuk M. tuberkulosis dan mikobakterium lain, sedangkan PCR multipleks selain digunakan untuk diagnosis, juga untuk tes resistensi terhadap OAT.
( Catatan Kuliah TLK Unhas )
by Ahmad Rifani
Dalam bidang kedokteran (manusia maupun hewan), uji-uji diagnostik merupakan salah satu metode untuk menangani kasus penyakit. Berbagai uji diagnostik telah dikembangkan, baik yang didasarkan pada teknik kultur agen penyakit, reraksi kimia/biokimia maupun reaksi imunologik. Dengan berkembangnya teknologi dalam bidang biologi molekuler, maka pengembangan uji-uji diagnostik mulai diarahkan kepada teknologi tersebut yang menggunakan materi genetik sebagai dasar pengujiannya.
Materi genetik yang berupa asam nukleat baik DNA (Deoxy-ribose Nucleic Acid) maupun RNA (Ribo Nucleic Acid) mengandung tiga komponen, yaitu: 1) basa (purin dan pirimidin); 2) gula (deoksiribosa untuk DNA dan ribosa untuk RNA); dan 3) fosfat. Basa purin yang terdapat pada DNA maupun RNA adalah sama, yaitu Adenine [A] dan Guanine [G] sedangkan basa pirimidin berbeda, untuk DNA adalah Cytocine [C] dan Thymine [T] dan untuk RNA kedudukan Thymine digantikan oleh Uracil [U] Kedua unsur basa tersebut (purin dan pirimidin) akan berpasangan membentuk kode-kode genetik pada DNA maupun RNA melalui ikatan hidrogen (A akan berpasangan dengan T [pada DNA] atau A dengan U [pada RNA]; dan G dengan C). Unsur gula dan fosfat akan membentuk struktur DNA dan RNA. DNA memiliki struktur rantai ganda sedangkan RNA memiliki rantai tunggal. Struktur DNA lebih stabil bila dibandingkan dengan RNA. Berdasarkan materi genetik tersebut, uji-uji diagnostik dikembangkan melalui teknik-teknik molekuler seperti hibridisasi dengan probe asam nukleat; polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan sekuensing asam nukleat.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Salah satu perkembangan teknik biologi molekuler yang sangat membantu dalam pengembangan uji-uji diagnostik adalah PCR. PCR dapat mengamplifikasi DNA dan jumlah yang sedikit menjadi jumlah yang dapat dideteksi/banyak. Adanya penemuan DNA polymerase (Taq polymerase) yang stabil pada temperatur tinggi dan pengembangan alat yang mengatur temperatur proses PCR secara otornatis, telah membuat PCR dapat digunakan untuk uji-uji diagnostik secara praktis. DNA polymerase adalah enzim yang dapat mensintesis rantai DNA yang baru dan DNA yang sudah ada. Penemuan enzim yang tahan panas sangat membantu untuk mensintesis DNA baru, karena tahap awal proses PCR dilakukan dengan cara pemanasan rantai DNA yang sudah ada pada temperatur 90°C.
Reaksi Rantai Polimerase atau Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik sintesis untuk mengamplifikasi atau melipatgandakan fragmen DNA target secara invitro dengan eksponensial yang menggunakan primer atau pemula DNA yang tepat. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA in vivo. Berbeda dengan proses replikasi yang berlangsung secara diskrit untuk sepanjang rantai DNA, maka pada proses PCR reaksi ini berjalan kontinu, tetapi hanya untuk satu segmen tertentu saja dari suatu DNA.
Teknik PCR ditemukan pertama kali oleh Kary, B. Mullis pada tahun 1985. Impian Mullis dimulai ketika di bulan April, malam Jumat, 1983, saat membawa kendaraannya keluar kota pada bulan purnama menuju ke Negara bagian utara California dimana Mullis mendapatkan inpirasi yang bermakna dengan menemukan cara baru untuk mendeteksi urutan basa yang spesifik dari DNA. Penemuan yang mempesonakan itu dipublikasi pada American Scientific, 1990, yang memberiny peluang pada tahun 1993 mendapatkan hadiah Nobel dalam kimia atas penemuan PCR. Semula Mullis menggunakan enzim Klenow fragmen E.coli DNA Polymerase I untuk memicu perpanjangan potongan DNA yang spesifik. Namun, enzim ini tidak dapat bertahan pada saat tahapan denaturasi dari PCR, sehingga mengharuskan penambahan enzim yang baru lagi pada setiap siklus PCR. Kondisi ini merupakan suatu hambatan yang kritis, khususnya pada teknik yang diharapkan berlangsung secara automatis. Klenow enzim dapat bekerja baik pada potongan DNA yang pendek (<200bp), tetapi tetapi tidak bis bekerja pada potongan DNA yang lebih besar, karena hasilnya yang memberikan sensitifitas yang rendah dan memperlihatkan hasil yang heterogen. Hal ini disebabkan karena tahapan annealing yang rendah dan perubahan temperatur (37’C) yang harus disesuaikan untuk mengaktifkan enzim Klenow. Situasi yang sangat memperihatinkan pada awal dimulainya PCR ini ialah bahwa teknik ini dilakukan secara manual dari satu waterbath ke waterbath lainnya sesuai tahapan dari PCR. Setelah beberapa tahun berikutnya didapatkan enzim thermostable DNA Polymerase yaitu Taq DNA Polymerase, PCR menjadi sangat populer dalam penelitian. Penemuan enzim ini juga memberi peluang untuk dilakukannya setiap tahapan PCR secara automatis, sehingga PCR sekarang telah dapat dikerjakan dengan mesin. Untuk mendeteksi potongan DNA yang spesifik dengan PCR diperlukan informasi dari tiap mikroorganisme yang memiliki potongan DNA yang spesifik untuk golongannya. Dengan merancang komplementer potongan DNA yang spesifik dari mikroorganisme tersebut, maka dapat dihasilkan pemula DNA atau disebut juga primer. Potongan DNA yang spesifik ini akan berikatan dengan pasangan yang komplementer dengannya, dan inilah yang dilipatgandakan atau diamplifikasi sampai jutaan dalam waktu sekitar 4 jam pada mesin PCR. Untuk mendukung amplifikasi tersebut diperlukan berbagai zat lainnya, kemudian divisualisasikan melalui elektroforesis dan proses hibridisasi. Keseluruhan proses PCR membutuhkan waktu hanya 2 hari. Pada perkembangan penggunaan PCR dilakukan pemurnian terhadap sampel yang akan di tes. Permunian sampel DNA dilakukan dengan memakai metode Boom (1990). Metode ini menggunakan Chaotropic agent guanidium thiocyanate (GuSCN) dan diatom. GuSCN dan diatom menghilangkan hambatan secara efisien terhadap berbagai macam sampel dari rumah sakit. GuSCN berfungsi untuk lisis dan menginaktifkan asam nukleat, sedangkan partikel silica ataupun diatom berfungsi mengikat asam nukleat. Untuk mengamplifikasi DNA dilakukan 30-40 kali siklus proses PCR. Satu siklus terdiri dari 3 tahap, yaitu tahap denaturasi pada temperatur 95°C, tahap hibridisasi primer pada temperatur 37° sampai 56°C dan tahap polimerisasi pada temperatur 72°C. Secara umum, DNA yang akan diamplifikasi diapit oleh sepasang primer sintetik yang merupakan potongan pendek dari DNA yang spesifik/komplementer yang berfungsi sebagai template dari DNA yang akan diamplifikasi. DNA target yang akan diamplifikasi didenaturasi terlebih dahulu dengan pemanasan, kemudian primer ditambahkan pada DNA target dan temperatur diturunkan agan terjadi proses hibridisasi. Bila tahap polimerisasi dimulai, maka rantai DNA target yang terdapat di antara primer akan diperbanyak menjadi dua rantai dengan panjang yang sama seperti DNA target. Dengan adanya pengulangan tahap-tahap denaturasi, hibridisasi dan polimerisasi beberapa kali, maka DNA target akan diperbanyak secana efektif. Bila enzim reverse transcriptase yang mensintesis DNA dan template RNA, digunakan pada tahap awal proses PCR, maka RNA ribosom dan genomik dan virus RNAjuga dapat diamplifikasi. Prinsip dasar suatu PCR adalah : pasangan primer menghibridisasi sekuens komplemen terget pada rantai DNA yang sebelumnya telah terdenaturasi. Sintesis DNA kemudian berlangsung dengan bantuan enzim polimerase di sepanjang daerah diantara primer. PCR dilaksanakan dengan cara menginkubasi sample pada temperatur yang berbeda pada tahap, dalam suatu siklus PCR, yaitu tahap : 1. Denaturasi Dengan pemanasan 95 oC rantai DNA akan berpisah, karena panas dapat merusak ikatan hidroksi antara basa-basa yang komplementar. 2. Annealing ( penempatan / pemasangan primer ) Primer dipasangakan pada tempat yang sesuai ( berkomplementer dengan rantai tunggal DNA ) melalui proses pembentukan iktan hidroksi.Untuk proses pemasangan primer ini dibutuhkan temperature yang berbeda dari setiap primer. 3. Extension ( Perpanjangan) Setelah primer ditempatkan pada posisi yang tepat, dimulailah proses pemanjangan rantai baru DNA yang berkomplementar, dengan bantuan enzim DNA polymerase sehingga terbentuk suatu fragmen rantai ganda DNA yang spesifik. Enzim yang stabil pada temperatur tinggi ini akan membantu proses penempaan nukleotida yang dibutuhkan sampai terbentuknya suatu rantai ganda DNA, temperatur optimal yang dibutuhkan untuk proses ini adalah 72o C. PCR dapat digunakan dalam uji-uji diagnostik untuk mengamplifikasi asam nukleat dan agen-agen penyakit yang ada dalam jumlah sedikit sehingga sensitifitas uji dapat ditingkatkan. DNA yang telah diamplifikasi selanjutnya diidentifikasi dengan teknik hibridisasi yang rnenggunakan probe asam nukleat yang spesifik, atau dengan analisis restriction fragment length polymorphism (RFLP) dan elektroforesis pada gel agarose atau dengan cara sekuensing. Perkembangan selanjutnya terhadap pemanfaatan mesin PCR, dibedakan antara PCR unipleks dan PCR multipleks. Bila digunakan hanya satu pasang primer disebut PCR unipleks, sedangkan PCR yang menggunakan lebih dari satu pasang disebut PCR multipleks tak ada perbedaan pada tahapan denaturasi, annealing dan elongation, terkecuali pada kandungan PCR-miks, waktu tahapan dan jumlah sikling temperatur. PCR Unipleks dapat dipakai untuk diagnosis terhadap penyebab penyakit infeksi, termasuk M. tuberkulosis dan mikobakterium lain, sedangkan PCR multipleks selain digunakan untuk diagnosis, juga untuk tes resistensi terhadap OAT.
( Catatan Kuliah TLK Unhas )
by Ahmad Rifani
Tidak ada komentar:
Posting Komentar